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30种中草药对耐药性猪链球菌的抑菌试验【莎普爱思】

发布时间:2019-08-13 16:11:32 阅读: 来源:柱塞泵厂家

30种中草药对耐药性猪链球菌的抑菌试验

(1. 解放军军需大学军事兽医系预防兽医学教研室, 吉林长春 130062;

2.阿克苏质量技术监督局质量与计量检测所;3.吉林农业大学动物科技学院)

摘要:为了观察中草药对耐药性猪链球菌的体外抑菌效果,将所选中草药按常规法制备水提取物,用平板打孔法和试管两倍稀释法检测中草药水提取物对耐药性猪链球菌的抑菌作用。结果所选30种中草药中8种对上述病原菌有中度以上抑菌作用。其中以维吾尔草药V抑菌作用最强,其次是柴胡、吴茱萸、维吾尔草药U、诃子和石榴皮。结果表明所选部分中草药中对耐药性猪链球菌有较强的抑菌作用。

关键词:猪链球菌;耐药性;中草药?

细菌的耐药性是全球关注的热点,用中草药降低或抑制细菌的耐药性是防止细菌耐药性产生的措施之一。我国中草药资源丰富,许多中草药被证实具有抗菌作用,并被广泛使用。但有关中草药对临床分离的耐药性猪链球菌抑菌试验鲜见报道,该试验旨在筛选对耐药性猪链球菌有强抑菌作用的中草药,为中草药在临床上治疗由耐药性致病菌引起的传染性疾病提供理论依据。?

1材料与方法?

1.1材料?

1.1.1药物参照《全国中草药汇编》在维吾尔民药中选取具有明显的清热解毒、固涩、驱风除湿、补虚、理气、泻下等作用的中草药,即黄连(E)、黄柏、黄芩、蒲公英(C)、没药、大蓟(N)、小蓟(O)、苦参(P)、苦地丁(J)、马齿苋(R)、鱼腥草(H)、菊花(H13)、茵陈(M)、乌梅(D)、诃子(B)、石榴皮(A)、半枝莲(H4)、柴胡(H8)、紫苏(H9)、半边莲(H10)、牛蒡子(H18)、玄参(H19)、吴茱萸(H14)、金莲花(H28)、苍术(H32)、中药(V)、中药(U)、刺山苷(老鼠瓜)(W)、铁角蕨(Y)、苦豆子(X)。其中,中草药V、U、刺山苷、苦豆子、铁角蕨来自新疆维吾尔民药。其余购自吉林市吉林大药房(括号内为该药的试验编号)。?

1.1.2水提取物的制备 每种中药各称取50 g,按常规加水浸泡3 h,文火水煎3次,合并3次滤液,浓缩至1/2体积约(150~200 ml),用60 ml离心管8 000 r/min离心10 min,取上清液,用滤纸过滤,然后浓缩为1 g/ml,调pH值至7?4~7?6,分装、流通蒸汽灭菌30 min,-20 ℃保存,待用。?

1.1.3 菌株 猪链球菌的耐药菌株受试菌株SS1、SS5、SS10、SS8、SS13、SYL,均为多重耐药菌株。?

1.1.4 培养基 采用MH(Mueller-Hinton,MH)肉汤和琼脂培养基,外加2?5%的裂解马血,配制方法参照《临床检验手册》。?

1.2 方法?

1.2.1 中草药对耐药性猪链球菌的抗菌活性 采用打孔法, 参照《中药药理实验方法学》等文献。 受试菌株为SS1、 SS5、 SS10、 SS8、 SS13、 SYL、 SS15, 在4 mm厚的MHA平板上打6 mm的孔, 每孔间距为30 mm, 将调制好的菌液(相当于107 CFU/ml),用灭菌棉签均匀涂在琼脂板上, 然后打孔, 每孔加中药药液70 μl(1 g/ml), 35 ℃培养20~24 h, 观察结果。 参照《微生物和检验技术》判定结果。抑菌圈直径≥20 mm高敏、 抑菌圈直径10~19 mm为中敏, 抑菌圈直径 10 mm为钝敏。?

1.2.2 中草药对耐药性猪链球菌的MIC测定 中草药的MIC测定参照试管两倍稀释法。稀释药液的制备:取7支13×100 mm灭菌的、插有石棉棉塞的试管,各管分别加MH肉汤培养基2 ml,在第一管加2 ml灭菌的中药提取物,混匀后,吸取2 ml加到第2管中,依次类推,直至第5管,第5管吸取2 ml弃去,使成1∶2,1∶4,1∶8,1∶16等浓度梯度。第6管不加中草药提取物作为对照,观察培养基是否有细菌的生长。第7管加受试中草药提取物2 ml,混匀后,不加菌液,以便观察受试中草药是否被污染。将选取的受试菌株SS1、SS5、SS10、SS8、SS13、SYL按常规法增菌、调制菌液,每管加稀释好的菌液50 μl(107 CFU/ml),35 ℃培养20~24 h观察结果。若药液透明,可直接判定结果;色泽较深,在培养结束后,挑取1铂金耳培养液于MH培养基上,划线培养16 h,观察结果,以无菌生长的最低稀释度为最小抑菌浓度(MIC)。?

2 结果?

2.1 中草药对耐药性猪链球菌的抗菌活性?

从30种中草药中筛选到针对所选菌株有明显抑制作用的中草药8种,其中,对猪链球菌耐药株高敏的中草药有中草药V;中敏的为中草药U、B、E、A、H14、H32、H13。结果见表1。2.2中草药对耐药性猪链球菌的MIC?

从表2可知,中草药V的MIC最小,其次是H8,第三为H14;高耐组SS1、SS5、SS13和SYL株显示出高的MIC值。?

3 讨论?

3.1 中草药对耐药性链球菌的作用机制?

中草药是我国广大劳动人民治疗各种传染性疾病智慧的结晶,资源丰富,历史悠久。已经证实多种中草药及其成分有抑菌或抗菌作用。国内关于中草药对大肠杆菌、沙门氏杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等抑菌、抗菌方面有大量的文献报道。但有关中草药对耐药菌的体外抑菌实验的报道很少,特别是关于用中草药抑制耐药性猪链球菌的研究鲜为报道。笔者参照《全国中草药汇编》从维吾尔民族医药中选取了30种中草药,用单味草药的水溶性提取物为实验药物,来观察所有提取物对耐药性猪链球菌的生物学作用。结果表明有8种中草药对多重耐药猪链球菌有明显的抑制作用,其中维吾尔草药V、U以及吴茱萸、诃子、黄连、石榴等尤为明显。选取中草药对耐药菌株的直接抑制作用可能是通过影响细胞壁的渗透屏障,使细胞质外流导致菌体死亡,也可能通过抑制细胞膜上的多种呼吸酶、合成酶,阻断其生物合成而达到抑菌。?

3.2 中草药的抑菌作用与耐药菌的结构关系?

大量的中草药体外抑菌实验表明,革兰氏阴性菌和阳性菌的体外抑菌效果有差异,常见中草药对革兰氏阴性菌的抑菌作用强于阳性菌,许多中草药对阳性球菌的抑菌作用比较弱,这与细菌的细胞壁的结构有关,革兰氏阳性菌细胞壁较厚,约20~80 nm。肽聚糖含量丰富,多达50层,形成坚固致密的三维立体网状结构,膜转运通道少,仅允许水分子,离子自由通过。而革兰氏阴性菌细胞壁较薄,肽聚糖含量低,仅有1~3层,脂质双层是革兰阴性菌细胞壁的主要结构,物质的转运通道较多,相对而言,中草药的提取成分容易穿过细胞壁,表现为较强的抑菌作用。则可以部分解释所选取中草药仅有26%有直接的抑菌作用。另外,有研究表明,当微生物产生耐药性后,细胞膜的结构比正常菌明显增厚,使物质的跨膜转运受阻,可能也是会导致中草药的水溶性成分通过细胞膜受阻,导致抑菌失败。本实验所选的中草药对耐药性猪链球菌菌株无抑菌作用为73%,除了本身链球菌的结构特点外,耐药性猪链球菌(分离株)对所选中草药的抵抗作用是否与细胞膜和细胞壁的结构不利于药物的通过有关,有待进一步的研究。?

中草药的体外抑菌强弱与提取物的成分和浓度密切相关。大多数中草药的水提取物浓缩到较高的生药浓度时,往往变得粘稠,这种提取物成分复杂,常含有生物碱、黄酮类、鞣质(内含焦性没食子酸和焦性儿茶酚)及没食子酸的衍生物、有机酸等多种抗菌、抑菌成分,也有蛋白质、淀粉、多糖、树脂等无抑菌作用的成分。这些无抑菌作用的成分往往会影响抑菌效果,不除去水提取物中的杂质,提高提取物中抑菌成分的浓度,则大多数中草药的抑菌效果难以呈现出来。若先用水提取,再用乙醇沉淀除去其中的杂质,反复多次,则可将其中的蛋白质、树脂等不溶性成分除去,保留如生物碱、甙类、氨基酸、有机酸等水溶性成分,提高了抑菌成分的浓度。本实验所用的中草药的提取物,未做醇沉淀去除杂质,对耐药性猪链球菌的抑菌作用有一定影响,显示仅有部分中草药有较强的抑菌作用,其它中草药的水提取物中的抑菌活性成分可能浓度太低,或其抑菌成分为脂溶性成分。单用水提取法使得大多数中草药抑制耐药性猪链球菌作用无法表现出来。?

中草药的体外抗菌抑菌实验方法较多,受多种因素的影响。所以目前急需解决中草药的抑菌、抗菌实验标准问题。打孔法等测定中草药的抑菌作用受多种因素的影响,有无抑菌作用以MIC为准。如本实验中打孔法检测柴胡的整体抑菌作用仅为29%。但其MIC结果显示有较强的抑菌作用。

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